Fluorescența este un efect fizic cauzat de emisia de energie luminoasă atunci când o substanță este iluminată de lumină sau de alte forme de radiație electromagnetică. Microscopia cu fluorescență este un microscop optic care utilizează fluorescența și fosforescența in situ sau în combinație cu reflexia și absorbția pentru a studia proprietățile optice ale obiectelor organice și anorganice. Microscopia cu fluorescență ajută la vizualizarea mai clară a structurilor subcelulare și interne ale obiectelor. A fost descoperit la începutul secolului al XX-lea de August Köhler, Carl Reichert și Heinrich Lehmann.
Index articol (click pentru a sări)
Cummicroscopie cu fluorescențălucrări
Funcționează la microscopie cu fluorescență
Componentele microscopului cu fluorescență
1. Fluorofor
2. Sursa de lumina
3. Filtru de excitare
4.Oglindă dicroică
5. Filtru de descărcare
Avantajele microscopiei cu fluorescență
Dezavantajele microscopiei cu fluorescență
Utilizări ale microscopiei cu fluorescență
Cum funcționează microscopia cu fluorescență
Microscopia cu fluorescență funcționează de obicei prin colorarea compoziției și structurii unei probe cu coloranți. Acest lucru se datorează faptului că majoritatea componentelor celulare sunt incolore în natură. Prin urmare, ele nu pot fi distinse cu ușurință unele de altele. Fluoroforii sau moleculele fluorescente iluminate cu lumină cu lungime de undă scurtă sau cu raze electromagnetice tind să emită lumină. Lumina emisă are o lungime de undă mai mare în comparație cu lumina incidentă. De obicei, durata dintre iradiere și emisie este măsurată în nanosecunde și poate fi ușor ignorată. Lumina emisă este separată de lumina incidentă, ceea ce indică locația exactă a fluoroforului. Imaginea probei este generată pe baza luminii secundare, mai degrabă decât a luminii incidente primare.
Funcționează la microscopie cu fluorescență
Microscopia cu fluorescență funcționează similar cu microscopia cu lumină. Este alcătuit dintr-o sursă de lumină puternică, un filtru de bandă special și o etichetă fluorescentă a probei. Proba de studiat este plasată la microscop. Lumina cu o lungime de undă suficient de scurtă pentru a excita fluoroforul este iluminată pe eșantion. Cu ajutorul unui obiectiv, această lumină este focalizată asupra eșantionului. Razele de excitație emise de probă sunt apoi focalizate pe detector prin lentila obiectivului. Partea principală a luminii de excitație este transmisă prin obiectul eșantion, în timp ce o parte din aceasta este reflectată înapoi și ajunge la detector.
Componentele microscopului cu fluorescență
1. Fluorofor
Un fluorofor este un compus care emite lumină atunci când este excitat de unde electromagnetice sau luminoase. Se mai numește și colorant fluorescent. Fluoroforii constau practic dintr-o combinație de grupări aromatice sau molecule plane/ciclice cu diferite legături π.
2. Sursa de lumina
Sursa de lumină este una dintre cele mai importante componente ale unui microscop cu fluorescență. Aici, cele mai frecvente surse de lumină utilizate pentru excitare includ lasere, LED-uri de mare putere, lămpi cu arc cu xenon, lămpi cu vapori de mercur etc.
3. Filtru de excitare
Filtrele de excitare utilizate în microscopia cu fluorescență sunt de obicei filtre trece-bandă, care permit semnale care se încadrează într-o lățime de bandă specifică, respingând în același timp toate celelalte semnale. Lungimile de undă absorbite de fluorofor trec ușor, în timp ce radiația optică reflectată este blocată.
4.Oglindă dicroică
Oglinzile dicroice acționează ca filtre cu peliculă subțire. Scopul principal al unei oglinzi dicroice este de a trece selectiv lumina dintr-o gamă mică de culori în timp ce reflectă toate celelalte culori. Este cunoscut și sub numele de filtru de culoare precis.
5. Filtru de descărcare
Filtrul de emisie este un filtru trece-bandă. Filtrele de emisie funcționează similar cu filtrele de excitație. Radiază lumina emisă de fluorofor în timp ce blochează lumina de excitație.
Avantajele microscopiei cu fluorescență
1. Sensibilitatea microscopiei cu fluorescență este foarte mare, egală cu aproximativ 50 de molecule pe micrometru cub.
2. Cu microscopia cu fluorescență, diferite molecule pot fi vopsite în culori diferite, permițând utilizatorilor să imagineze mai multe molecule ale unei substanțe în același timp.
3. Microscoapele cu fluorescență sunt mai eficiente decât microscoapele optice tradiționale.
4. Poate fi utilizat pentru imagistica in vivo și in vitro.
5. Microscopia cu fluorescență poate separa proteinele individuale cu mare precizie.
6. Microscopia cu fluorescență este cea mai potrivită pentru imagistica și studierea comportamentelor dinamice prezentate de celulele vii.
7. Microscopia cu fluorescență este capabilă să producă imagini clare și de înaltă rezoluție, sporind astfel cercetarea.
8. Combină proprietățile de mărire ale microscopiei optice cu vizualizarea fluorescenței.
9. Microscopia cu fluorescență poate fi utilizată pentru a genera imagini 3D mărite ale probei studiate.
Dezavantajele microscopiei cu fluorescență
1. Compușii fluorescenți sau fluoroforii prezenți în microscopia cu fluorescență tind să-și piardă capacitatea de a emite lumină în timp atunci când sunt excitați din cauza unui proces numit fotoalbire. Fotoalbirea apare de obicei atunci când o moleculă de fluorofor este deteriorată chimic din cauza excitației electronice în timpul fluorescenței.
2. Permite doar observarea și studiul anumitor structuri din eșantion care au fost evidențiate și etichetate ca fluorescente.
3. Când materialele fluorescente sunt iradiate de lumină, moleculele fluorescente produc adesea substanțe chimice, ceea ce duce în continuare la fototoxicitate. Acest efect fototoxic distruge proprietățile originale ale probei observate. Fototoxicitatea radiației luminoase cu lungime de undă scurtă este relativ mare.
4. Microscopia cu fluorescență nu poate oferi informații despre stratul dublu lipidic, în special pentru SUV-uri.
5. Microscopia cu fluorescență nu poate oferi observații concludente legate de caracterul bistrat sau lamelaritatea veziculelor.
6. Adăugarea de sonde și coloranți interferează adesea cu proprietățile veziculelor lipidice, ducând la interpretarea inexactă a datelor și, prin urmare, distrugând autenticitatea experimentului.
7. Peroxidarea lipidelor indusă de lumină poate duce la formarea unui domeniu.
Utilizări ale microscopiei cu fluorescență
1. Microscopia cu fluorescență este utilizată pe scară largă pentru a studia structura internă a probelor la nivel microscopic cu cea mai înaltă calitate.
2. Microscopia cu fluorescență este cea mai potrivită pentru studiul probelor biologice vii.
3. Acest tip de microscop este adesea preferat atunci când se etichetează structurile cele mai interioare ale celulelor sau microorganismelor.
4. Ajută la măsurarea stării fiziologice a celulelor sau a probelor observate.
